小小纳米铜粒子还能杀菌？背后原理你肯定想不到

点击蓝字 关注我们

微末生物

Nanomega BioAI

铜（Cu），一种离我们的生活不远不近的独特元素——虽然你不会常常见到这种金属，但因为有着极强的导电性、耐腐蚀性和良好的延展性，铜在高压长途输电、机械制造、电子元件等多个领域有着广泛应用。近年来，基于Cu的微型粒子制剂，如微米铜、纳米铜、纳米氧化铜和铜离子制剂等逐渐走入大众视野，并被广泛用于抗菌（antimicrobial）和防污（antifouling）涂料等方面。

然而，正是因为拥有能够杀伤单细胞生物的性质，Cu相关制剂的安全性同样也引发了环境和生命科学家的担忧。如何评估纳米铜粒子（nano-Cu，n-Cu）等铜相关纳米制剂和其他尺度（微米、离子）下的铜相关制剂的生物毒性？nano-Cu制剂独特的杀菌特性背后又隐藏着怎样的细胞和分子机制？

纳米铜颗粒

何为纳米铜？或许你在平日生活中已经听说过很多“纳米材料”：碳纳米管，石墨烯，纳米银——作为一种新型材料，它几乎已经成为了家喻户晓的“高科技”代名词。因为有着宏观材料所不具备的多重效应（如量子尺寸效应），这一类由纳米量级（1-100nm）的晶态或非晶态超微粒为基本结构单元构成的材料在多个方面不断展现出极其独特的性质，这也使它们成为了吸引着材料化学界学者开疆扩土的一片“新大陆”。2023年的诺贝尔化学奖就颁给了三位杰出的材料学家，以表彰他们对量子点——化学粒子在纳米尺度下光特性的发掘。

作为纳米材料的一员，这些独特的性质在“纳米铜”身上同样可见。纳米铜粉具独特的的导热、导电、润滑、抗菌、催化性能为其赋予了作为新型电子浆料、润滑油改性剂、抗菌材料、工作催化剂的潜力。其中有一种性质格外重要——以nano-Cu为首的大量Cu相关纳米制剂展现出了【细胞毒性】，即能够危害细胞的正常生长和生存，因而有作为细菌、真菌抑制剂、水质净化剂的潜力。以往的大量研究表明，这些纳米铜相关制剂能够抑制绿藻、水蚤等真核单细胞和多细胞水生生物的生长，而对原核生物细胞，如革兰氏阴性（G-）（注释①）的大肠杆菌（E.coli）等更是有着明确的、通过氧化应激等方式造成的杀伤作用。

然而，也有一些研究表明，纳米铜相关制剂可能对人体健康造成威胁。由于纳米铜制剂正在逐渐进入人们的生活，这一问题不仅会引发公众担忧，还可能带来切实的健康隐患。更要命的是，纳米铜作为杀菌剂在药物、除臭剂和食品添加剂上的应用还有一份“前车之鉴”——同样作为抑菌重金属颗粒的【纳米银】，就是因为具有难以代谢和潜在的神经毒性问题，而被欧美国家禁用于纺织品中。

另外，纳米铜材料杀菌的根本原理也尚不清楚。之前对于纳米颗粒细胞毒性的一些研究称，纳米材料本身的毒性来源于其在溶剂中解离出的重金属离子，而非纳米粒子本身；因此，“纳米粒子”本身可能并不存在真正的“杀菌”作用，而是一个单纯的重金属离子载体。这一争论曾经发生在对纳米银粒子的讨论之中，但最后以证实纳米银颗粒具备不同于Ag+的细胞毒基本原理而告终。但对于纳米铜相关制剂这类新材料来说，这一问题还未得到阐明。

怀着这些疑问，研究人员向纳米铜发起了挑战。

初步的毒理判定

进入“检验列表”的是四种纳米颗粒和两种微米颗粒（图1）——纳米颗粒包括纳米铜n-Cu，纳米氧化铜n-CuO，还有两种氢氧化铜Cu(OH)2（氢氧化铜是在抗真菌和抗细菌中应用最广泛的铜相关纳米制剂）。微米颗粒则包括直径更大的微米铜m-Cu和微米氧化铜m-CuO。与他们做对比的离子尺度的Cu2+分别是CuCl2和CuSO4.研究人员测定了它们包括粒子大小、Cu2+离子释放程度和水流动力学直径在内的一些物理性质（图2）。

检验所用的细菌则是两种——革兰氏阴性菌的代表，大肠杆菌E.coli，和革兰氏阳性菌的代表，左旋短乳杆菌L.brevis。二者都是人类肠道菌群的重要成员。

图1 接受检验的不同大小尺度的铜制剂和两种细菌

在定量测定阶段，研究人员发现所有铜试剂样品都能够以一种剂量依赖性的方式导致细菌细胞的生长抑制。但关键问题在于不同样品之间的效果是否会存在区别，以及效果背后存在着什么样的原理。

对半抑制浓度（IC50，图2，下）的测定表示，不同样品的杀伤力，以及作用在不同菌体上的杀伤力都迥然不同。在【大肠杆菌】上，离子试剂CuCl2和CuSO4，纳米试剂n-Cu和n-CuO都表现出了非常强烈的杀伤作用（IC50<200μg/ml），而反观两种n-Cu(OH)1和2以及两种微米试剂m-Cu和m-CuO就要逊色许多。在无外层脂质膜作为保护的革兰氏阳性菌【左旋短乳杆菌】上，各种试剂的表现出的毒性普遍有所提高；但研究人员通过计算“生存曲线下面积”来比较不同试剂的毒性，很快发现这主要并不是因为二者在细胞结构上有差异，反而是因为二者培养液中铜粒子所能解离出的Cu2+量不同。

在这一场『初步判定』中，总的来看，纳米铜试剂的毒性远强于直径较大的微米铜试剂，而和铜离子试剂基本持平。

图2 研究人员对不同试剂的性质和毒理进行定量测定

纳米铜比微米铜『强』在哪里？

是独特的纳米颗粒，还是单纯的离子载体，还是两者兼具？这是一个重要的问题。之前在银纳米颗粒中就有过类似的争论，而这一次，面对铜纳米颗粒，研究人员通过计算不同指标之间的相关系数，分析了各因素对n-和m-这两种粒子毒性差异的影响。

那么，纳米Cu的高毒性……

• 是因为Cu2+离子从纳米颗粒上解离得更快？——研究人员发现，毒性和颗粒释放离子的程度存在一定的相关性，但不算很强烈。

• 是因为纳米粒子可以吸附到细胞膜上？——理论上讲，这种吸附性质作为纳米材料的特点，同时具备了破坏细胞膜和向细胞内快速投递高浓度Cu2+的功能。但是，实验测定和数据分析表明，此处相关性也一般。

• 是因为纳米材料能够让更多的Cu进入细胞内部？——研究人员使用了一种能够将细胞内铜元素浓度转变为荧光信号强度的E.coli“工程菌”，可以通过荧光的测定来反映细胞内铜含量的真实数据。计算发现，这一指标和毒性的相关性达到了r=0.98！这是远高于其他因素的高度相关性，也就是说，【细胞内可接触性Cu元素的浓度更高】是纳米铜比微米铜细菌杀伤力更强的“最好解释”。

在这里，研究人员还发现n-Cu处理组的细胞内Cu浓度，与CuCl2离子处理组（目前毒性最强的一组）的Cu浓度相持平甚至更高。这为他们接下来探讨n-Cu杀死细胞的深度机理提供了思路的源泉。

谜底揭开：纳米铜到底为何不同？

随后，研究人员基于“亚致死性分析”的方法对毒素杀伤细胞的具体机理进行了分析。这一方法在现有已知四种主要细胞致死因素（图3，四列分别为膜电位失衡、膜损坏、活性氧ROS和电子传递链损伤）的基础上，先用四种已知的“标准毒素”来分别展现这四种损伤及其对应标志，然后在Cu试剂处理过的细胞中检查这四种标志。与“标准毒素”的作用越相似，就表明这种损伤因素在Cu试剂处理的过程中的发生越强烈（体现为红色）。

在分析过程中，他们发现，纳米制剂和离子制剂都“稳定发挥”，而微米制剂仍然是“反响平平”；不过，在比较纳米制剂和离子制剂时，有两个毒性因素“鹤立鸡群”。

其中一个是膜电位的变化。和纳米制剂组相比，两种【Cu2+离子】明显在破坏细胞膜电位方面更加有效。这和以往的研究一致。

然而，另一个因素却是为【纳米粒子】所独有的，特别是在大肠杆菌中，竟然为n-Cu这一组所独占——这就是“生物活性氧”ROS的产生（图3，E.coli组和L.brevis组，第三列）。在这个方面，纳米铜相比于铜离子试剂，占据了绝对优势。

图3 用亚致死性分析探究各试剂的细胞毒性原理

这时，研究人员意识到，根据以往的研究，纳米铜能够在体外打断核酸片段。他们首次在体外对纳米铜及其他试剂的双链DNA切割活性做了检查，发现对于超螺旋双链DNA质粒来说，仅有n-Cu和m-Cu两种粒子能够最有效地完成这一过程（图4，A），而Cu2+离子反而切割效率一般。从体外产生活性氧的效率来说（图4，B），也是n-Cu和m-Cu能够产生最多的活性氧。活性氧的产生无疑是二者能够高效切断DNA的主要因素。

图4 铜制剂对双链DNA的切割实验及体外活性氧产生情况

眼见为实：电子显微镜立功

 n-Cu和m-Cu都能高效切断DNA，但二者的毒性相差很大。从颗粒大小上看，这很可能是因为m-Cu更难进入细胞。研究人员通过透射电镜TEM成功证实了这一点。在TEM打出的图像中，m-Cu和m-CuO组的细菌内部“干干净净”，完全没有高电子密度的铜粒子的“黑影”（图5）。微米试剂既然不能进入细胞，就无法切实地接触到细菌的基因组，一身武功全无所用之地。而这，也就是纳米铜试剂能够与Cu2+离子的细胞杀伤力比肩，甚至超过Cu2+离子的关键所在。

铜离子非常擅长破坏细胞膜电位，如果纳米铜想要与之竞争，单纯依靠释放铜离子是不现实的。但是，纳米铜找到了“另一条赛道”——凭借自己灵活的躯体进入细胞，发挥自己能够产生ROS的特性，“贴脸爆破”细菌的基因组。正是这一独特的能力为它赢得了和铜离子的杀伤性相持平的地位。预测为虚，眼见为实，研究团队使用电子显微镜对细菌进行直接成像来使自己的假设得到证实，是非常巧妙的选择。

最后，研究人员利用透射电子束三维断层成像技术（Electron tomography 3D construction，ET，图5下，注释②），从相互垂直的两个角度分别对细菌内部的铜粒子进行了三维成像，证实了纳米铜粒子确确实实能够通过部分破损的细胞膜进入细菌细胞。这一研究始于实验测定，终于电镜成像，通过抽丝剥茧、层层比较，终于揭示了纳米铜离子毒杀细菌细胞的独特机理。这也为铜纳米制剂的广泛应用所带来的环境和健康风险提出了警示。

图5 使用透射电镜（TEM）和断层扫描技术（ET）对细菌细胞内的纳米铜粒子进行成像

透射电镜（TEM）作为一种纳米级别分辨率的成像仪器，在前沿生命科学研究项目中发挥着无比基础而重要的作用。将这一技术和材料、环境等学科交叉联合起来，活用电子显微镜进行研究，将为科研创新成果的产出提供巨大帮助。目前，中科微末团队致力于为药企和高校科研工作者、医院科研工作者提供一站式、自动化、原子级分辨率的透射电镜和冷冻电镜三维结构解析等服务，助力科研创新项目推动和成果转化，帮助科研人员实现“电镜自由”。

①革兰氏染色：一种利用细菌细胞壁生化性质不同对细菌进行染色分类的方法，可将细菌分成阳性（G+，如乳酸菌）和阴性（G-，如大肠杆菌）两类，是微生物学研究乃至临床检验中最基础也是最重要的染色方法。G+的细胞壁主要为肽聚糖层，而G-细胞壁最外层为脂质外膜，内层为较薄的肽聚糖层。相对而言，G-的脂质外膜起了较强的过滤作用，为G-菌提供了更强的细胞毒素抗性。

②这里是树脂包埋切片后使用透射电镜进行的三维断层扫描成像（ET），不涉及冷冻（Cryo-）过程，在材料科学中更加常用。电子束穿透薄样品产生的各种信号可以用来进行三维成像。通过对一系列样品进行倾转并采集二维图像，可以合成得到最终的三维结构。相比于基于X射线的断层成像，ET的优势不仅在于极高的空间分辨率，更重要的是多样的信号可以对样品的化学组成，电子态，晶向，位错，缺陷等进行三维成像。

微末生物

Nanomega BioAI

请关注微末生物

期待与您交流