25年前，人类第一次看清单纯疱疹病毒

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前言

这篇文章是早期冷冻电镜研究的一个典型代表，主要由来自德克萨斯大学休斯顿医学院病理与检验医学系的周正洪教授所在团队完成，目的是对单纯疱疹病毒1型的外层包膜、衣壳蛋白及其基因组DNA进行三维结构成像。周正洪教授于20世纪90年代起，至今长期从事于冷冻电子显微镜成像相关的研究方向，在冷冻电镜领域以第一作者及通讯作者身份发表多篇顶刊文章。本文于1999年发表于Journal of Virology。

在这篇文章中，作者用冷冻电镜对单纯疱疹病毒I型进行观测，首次揭示了病毒微粒的三维结构，并在此基础上将病毒微粒的被膜－衣壳之间的相互作用可视化。作者的研究证明，在病毒感染过程中，被膜蛋白可能在调节其基因组DNA（通过特定通道）组装进入衣壳的过程中，或者与细胞内部运载蛋白的结合方面发挥作用。在冷冻电镜技术发展成熟的早期阶段，周正洪教授所在团队利用这一技术研究大型生物颗粒及其三维结构，在病毒学研究中发掘了新的科学现象，并推动了这一强大的生物成像技术在病毒及微生物学的研究领域中广泛应用。

研究背景

一、I型单纯疱疹病毒

水泡、溃疡等轻型皮肤疾病的背后，常常有一位“罪魁祸首”——单纯疱疹病毒1型（HSV-1）。这一病毒参与感染了大约80%的全球人口。作为最大和最复杂的病毒之一， HSV-1病毒粒子具有比较经典的病毒结构——由基因组核心、蛋白质衣壳、蛋白质被膜（Tegument）及由双层磷脂分子构成的囊膜组成。

图1: 单纯疱疹病毒导致的皮肤水泡症状（左，图源默沙东诊疗手册），单纯疱疹病毒I型的三维结构模型（右）

核心：由152,000个碱基的双链DNA基因组组成，缠绕成纤丝卷轴；

衣壳：二十面体对称，包裹核心，由162颗微粒组成，直径100nm ；

被膜：衣壳外有一层蛋白质被膜覆盖，厚薄不匀；

囊膜：最外层为典型的病毒脂质双层囊膜，上有突起。

有囊膜的病毒直径为150～200nm。囊膜表面含多种糖蛋白，与病毒对细胞吸附/穿入（gB gC gD gE ）、控制病毒从细胞核膜出芽释放（gH）及诱导细胞融合（gb gC gD gH）有关，并且有诱发动物产生中和抗体（gd 最强）和杀伤细胞的作用（已知的HSV糖蛋白均可）。当前，囊膜病毒基因组DNA在衣壳内的精确排列方式尚不清楚【作者研究问题1】。

衣壳的主要功能就是包含和保护病毒脆弱的DNA基因组。在细胞外，它被更加外层的「被膜」和「囊膜」包围着。所谓“被膜蛋白”通常被定义为那些除了纯化得到的衣壳蛋白或者位于脂质分子双层膜“囊膜”成分之外的一些结构蛋白。“被膜蛋白”中的一部分已被证明参与了感染过程中的早期事件，然而，许多被膜蛋白可能参与病毒生命周期中的多个部分，而它们的功能尚不清晰。

因此，对被膜性质的探索主要来自对第二种由被感染细胞产生的病毒颗粒的鉴定——L颗粒。「L颗粒」仅仅由被膜和囊膜组成，然而是“空心”的结构，不具备衣壳和核心部分，所以无感染性。L颗粒的存在表明，被膜具有固有的结构完整性，其组装可以独立于衣壳进行。然而，被膜并不具有独特的几何结构，被膜中每种蛋白质以不同的、可能的半随机方式相互作用。

然而，由于衣壳和被膜的紧密联结，二者的存在特定的、某种形式的相互作用几乎是一个必然的现象，尽管当前尚无明确的证据【作者研究问题2】。

二、冷冻电镜

“被膜结构”因为其难以分析的性质而成为病毒组分中特征最不明确的一个。当前关于被膜组织结构的大部分信息都来自经典的透射电子显微镜（TEM）可视化技术，如薄片、负染色和冷冻蚀刻等。当前，病毒衣壳的结构已经能够通过冷冻电子显微镜和计算机重建方法在较高分辨率条件下进行呈现。

作者应用冷冻电子显微镜和计算机重建来研究完整的、有感染性的HSV-1病毒的三维结构。通过对重组病毒颗粒和纯化衣壳的比较，首次揭示了完整HSV-1病毒粒子中衣壳－被膜之间的相互作用和病毒DNA核心组分的微观结构。

对病毒粒子进行冷冻电镜成像

研究人员首先利用400千伏电子低温显微镜对嵌入玻璃冰中的HSV-1病毒体进行成像。图像显示大多数病毒颗粒完整，具有平均直径为2000 Å的清晰包膜。他们首先选择完整病毒颗粒的图像进行进一步的数据处理，并在计算上将围绕在壳体中心的半径为1,050Å的区域框出，以确保被膜和病毒包膜信号被囊括在数据分析中。

最终，他们从18张电子显微照片中挑选出了146个病毒粒子的二维图像，通过图像分析方法获得了有效分辨率为20 Å的病毒颗粒模型。为了使二十面体形状的衣壳可视化，作者对病毒粒子的半径范围进行了三维重建。在下图（右）的模型中，六边形的衣壳蛋白复合物为蓝色，并从三联体（绿色）和衣壳层（黄色）向外延伸。衣壳外的散乱密度半径为625 Å，用紫色表示。衣壳表面外的大部分密度表现为不连接的团块，不同重建模型的比较表明其位置不一致。这说明衣壳外面的糖蛋白包膜和大部分的被膜蛋白都不具有二十面体的对称性。

图2: 对HSV-1病毒粒子的初步成像

图3的坐标曲线图显示了在病毒颗粒重建模型中，颗粒半径上的平均密度分布。为了方便比较，作者绘制了与同样的20Å分辨率计算的HSV-1 B－衣壳结构的径向密度分布曲线（图3，虚线）。从感染细胞的细胞核中纯化出的B－衣壳结构包括外部的二十面体衣壳和一个蛋白质核心或支架，但缺乏病毒DNA、被膜和包膜。

病毒颗粒整体的密度分布谱类似于B－衣壳，在衣壳（caspid）区域有三个密度峰。然而，密度峰的相对高度有所不同，在病毒颗粒的密度分布谱中，两个外部峰值相对衣壳较高，表明在衣壳外部区域还存在额外的密度分布。在衣壳内部，由病毒DNA引起的密度分布呈现为一系列连续的密度峰（图中标注为dsDNA部分，最多10个），峰与峰之间相距约26Å。与B－衣壳空洞的内部支架不同，DNA填充了病毒颗粒的衣壳内部空间。在整个病毒颗粒中，延伸到约1,000Å的半径位置是被膜，它可以看作是一个相对低密度的区域。在约880Å半径处，被膜的密度开始下降，反映了个体病毒颗粒尺寸的变化和衣壳从病毒颗粒中心的位移。在衣壳周围的区域（半径在600到635Å之间），密度分布达到最小值，表明衣壳和被膜成分之间几乎没有连续性。

图3: 依据冷冻电镜数据计算HSV-1 B－衣壳结构的径向密度分布曲线

被膜－衣壳－基因组

相互作用的可视化研究

接下来，作者对病毒颗粒的轮廓进行重建。相较于图2中使用的较低的密度阈值，此处重建条件进行了调整，所采用的密度阈值更高。该阈值下，半径超过650Å的非二十面体相关成分（也就是图2中的粉色颗粒样物质）消失。

下图揭示了以前在生化方式纯化的HSV-1衣壳中看到的特征性二十面体晶格。为了突出病毒粒子和纯化衣壳之间的差异，研究人员在病毒粒子图谱（图4A）和重建到相同分辨率的纯化B－衣壳图谱（图4B）之间计算了差异图谱（图4C）。这张图表明除了在五聚体及其邻近的三聚体衣壳蛋白周围的局部区域和衣壳内的部分空间外，它们的整体形态是相似的。衣壳具有相同的内径和外径，亚基的组织结构也不变。具体地说，病毒粒子中的衣壳部分和经过纯化的衣壳蛋白在一些部位看起来难以区分，这表明它们不会因覆盖层的存在而改变。

图4: 病毒粒子三维结构和纯化的衣壳蛋白三维结构模型对比

相比之下，这两张模型图在五联体衣壳蛋白区域存在明显的差异，这一部分在对比模型图上以颜色突出显示（下图左）。最明显的区别是从五联体部分表面延伸出来的额外物质的存在。额外的密度显示为一条连续的、曲折的“丝带”状结构（黄色），长约200Å，厚约40Å，这种密度从五股体中两个相邻病毒蛋白亚基的上域之间的界面延伸到五角形三联体（Ta）及其最近的邻近三股体Tc边缘，分布在它们上表面的不同位置（图5，右）。它还与六聚体衣壳蛋白复合物中两个亚基的中间结构域（图右，左上角，蓝色为六聚体）相接触。这种额外物质的质量大约在170到200 kDa之间，这是以前在A-、B－或C－衣壳重建中未发现的。在病毒粒子重建中存在这样的外部密度表明它们是被膜蛋白。

图5: 在病毒颗粒的冷冻电镜图像中捕捉到被膜蛋白的成分

病毒粒子和纯化的B－衣壳结构之间的一个不太明显的区别是五联体通道的关闭。病毒衣壳的五联体通常构成一个开放的通道，但从B－衣壳和病毒粒子的五联体剖面图的比较中可以明显看出，这一通道在病毒颗粒中呈现闭合状态。闭合的区域是在B－衣壳中被来自VP5中间结构域的突起所压缩的区域（图6A）。此外，在病毒粒子（图6B）中的五联体通道下有很强的密度，这可以归因于病毒DNA的存在。

图6: 对比发现，病毒粒子五联体通道在内部含有DNA的情况下是关闭的

前面的径向密度折线图（图3）显示，病毒DNA的存在使病毒粒子衣壳内的密度呈现出规则的多个峰连续排列的模式；病毒粒子沿双重轴重建的横断面图（图7）则显示在衣壳状底板内表面内排列成多个壳的高密度特征。在衣壳中心的图案变得模糊难辨之前，至少可以很容易地区分出六个同心的壳层（图6)。在粒子的原始图像（图7a到d）和计算的衍射图案（图7e到h）中可以看到与图3中计算得到的相同的26 Å间距。

图7：病毒粒子的三维重建模型，展示了病毒内部的横断面图

在这个间距上的衍射强度的分布图案似乎是不同的，不仅在不同取向的粒子之间，而且在二十面体等效取向的粒子之间也存在差异（图7e到h)。由于这些取向是通过假设其存在二十面体对称性来确定的，所以这种差异事实上表明病毒颗粒内部的DNA组织也缺乏二十面体对称性。为了证实这一点，作者计算了两种不同重建模型中DNA密度分布之间的关联度，并发现DNA密度在重建之间的相关性确实很差，因此它们不是二十面体形态的。故而在其后的重建中，集中排列的DNA层通过二十面体平均被排列为密度均匀的壳层。

在此研究过程中，冷冻电镜在前期收集实验数据，呈现病毒颗粒微观结构的方面发挥了不可替代的作用。通过使用冷冻电镜三维重构方法，研究人员能够对在玻璃态冰中的病毒结构进行清晰成像，并将其组分结合径向密度分布图进行三维重建，最终得以还原病毒的主要组分之间的相互作用关系。同时，研究人员还揭示了DNA分子在I型单纯疱疹病毒中的排列方式。此外，冷冻电镜也使得对五角通道的状态转变分析成为可能，进一步为病毒成分及致病基因以及探索未来潜在的候选蛋白靶点提供了非常重要的思路。

早在1999年，周正洪教授及其合作者就已经开始利用冷冻电镜研究生物大分子的三维结构。中科微末团队在使用Cryo-ET和Cryo-EM等多种技术解析生物大分子及其复合物的三维结构方面技术成熟、经验丰富，能够在近原子级分辨率解析多种生物大分子材料的三维结构，为您提供“眼见为实”的结构信息。我们致力于为药企和高校、医院的科研工作者提供一站式、自动化、原子级分辨率的结构解析服务，助力创新药物研发和科研成果转化，助您实现“原子结构自由”。

期刊介绍

本文发表期刊Journal of Virology 创刊于1997年，是一本探索动物、古菌、细菌、真菌、植物和原生动物病毒的生物本质，对病原菌结构、活性、生物学功能进行探索的一本期刊。

每期发表的研究成果涵盖病毒体结构和组装、病毒基因组复制和基因表达调控、遗传多样性和进化、病毒-细胞相互作用、细胞对感染的反应、肿瘤发生和转化、基因传递、病毒发病机理和免疫、疫苗等多个方面。1999年，Journal of Virology的影响因子为5.93。

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